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质粒DNA的小量制备
细菌的收获和裂解
收获
碱裂解法
煮沸裂解
质粒DNA小量制备的问题与对策
质粒DNA的小量制备可采用下述的碱裂解法或煮沸法
(一)细菌的收获和裂解
1.收获
1)将2ml含相应抗生素的LB加入到容量为15ml 并通气良好(不盖紧)的试管中，然后接入一单菌落，于30℃剧烈振摇下培养过夜。
2)将1.5ml培养物倒入微量离心管中，用微量离心机于4℃以12000g离心30秒，将剩余的培养物贮存于4℃。
3)吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，轻缓抽吸，并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时，尽可能使吸头远离细菌沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管壁的液滴。
2.碱裂解法
1)将细菌沉淀，所得重悬于100μl用冰预冷的溶液I中，剧烈振荡。
溶液I
50mmol/L葡萄糖
25mmol/L Tris.Cl(pH8.0)
10mmol/LEDTA(pH8.0)
溶液I可成批配制，每瓶约100ml，在10lbf/in2(6.895×104Pa)高压下蒸气灭菌15分钟，贮存于4℃。须确使细菌沉淀在溶液I中完全分散，将两个微量离心管的管底部互相接触震荡，可使沉淀迅速分散。
2)加200μl新配制的溶液Ⅱ。
溶液Ⅱ
0.2mol/L NaOH(临用前用10mol/L贮存液现用现稀释)
1%SDS
盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物。应确保离心管的整个内表面
均与溶液Ⅱ接触。不要振荡，将离心管放置于冰上。
3)加150μl用冰预冷的溶液Ⅲ
溶液Ⅲ
5mol/L乙酸钾 60ml
冰乙酸 11.5ml
水 28.5ml
所配成的溶液对钾是3mol/L，对乙酸根是5mol/L。
盖紧管口，将管倒置后和地振荡10秒钟溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后
将管置于冰上3-5分钟。
4)用微量离心机于4℃12 000g离心5分种，将上清转移到另一离心管中。
5)可做可不做:加等量酚:氯念，振荡混匀，用微量离心机于4 ℃以12000g离心2分钟，将上清转移到另一良心管中。有些工作者认为不必用酚:氯仿进行抽提，然而由于一些未知的原因，省略这一步，往往会得到可耐受限制酶切反应的DNA。
6)用2倍休积的乙醇于室温沉淀双锭DNA。振荡混合，于室温放置2分钟。
7)用微量离心机于4℃以12 000g离心5分钟。
8)小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时，尽量使吸头远离核酸沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管壁的液滴。
9)用1ml70%乙醇于4℃洗涤双链DNA沉淀，按步骤8)所术方法去掉上清，在空气中使核酸沉淀干燥10分钟。
i.此法制备的高拷贝数质粒(如Xf3或pUC)，其产量一般约为:每毫升原细菌培养物3-5μg。
ii.如果要通过限制酶切割反应来分析DNA，可取1μl DNA溶液加到另一含8μl水的微量离心管内，加1μl 10×限制酶缓冲液和1单位所需限制酶，在适宜温育1-2小时。将剩余的DNA贮存于-20℃。
iii.此方法按适当比例放大可适用于100ml细菌培养物: